Southern Blot 实验指南
基本概念
原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到**纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
实验步骤
一、基因组DNA的制备
二、基因组DNA的限制酶切
根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入
DNA（1μg /μl）-------------------------------20 μg
10×酶切buffer --------------------------------4.0 μl
限制性内切酶（10U/μl）------------------5.0 μl
加ddH2O 至----------------------500 μl
在最适温度下消化1-3Hour。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。若消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6 Hour已没有必要。或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。
消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA，以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解。
如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。
三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。
表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围
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琼脂糖凝胶浓度（%） |
分离DN**段范围（kb）表： 不同浓度琼脂糖凝胶分离DN**段的范围 |
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0.3 |
5-60 |
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0.6 |
1-20 |
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0.7 |
0.8-10 |
|
0.9 |
0.5-7 |
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1.2 |
0.4-6 |
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1.5 |
0.2-3 |
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2.0 |
0.1-2 |
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