荧光分子可以说是生物学研究中最经常使用的标记分子，它们作为探针标记目标分子，可用于监测其表达量及示踪。它们相对于放射性同位素更加安全和环保，相对于不发光的标记物如HRP或金属颗粒等更加灵敏，因而应用非常广泛。下面我们将从荧光的发光原理开始，简单介绍免疫荧光（IF）和流式细胞术（FCM）的应用。

光是一种可见的电磁波，是能量的辐射形式。光的波长越长，光子的能量越小。

光进入某物质后，部分或全部的光能可被物质的分子或原子所吸收。光的吸收具有选择性，一定能量的光量子辐射只能被一定结构的物质吸收。

荧光的基础知识：荧光是物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。

荧光物质的种类：芳香族及杂环化合物、荧光蛋白、纳米颗粒（量子点）。

荧光物质发光原理：光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，瞬间将恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，产生荧光。

能级跃迁

每一种荧光物质都有其特定的激发光谱（Excitation）和发射光谱（Emission）。通常以相对强度为纵轴，以波长为横轴，这些吸收光谱和发射光谱有很好的对应关系。激发光谱是固定发射光的波长，测量激发光的波长（有时候也测波数或者频率等）与荧光强度之间的关系；发射光谱是固定激发波的波长，测定发射光强度与波长的关系。荧光物质的发射波长总是大于其激发波长。 两者的差值即为斯托克斯位移（Stokes shift）。

斯托克斯位移（Stokes shift）

可根据这种荧光素的激发谱线来确定荧光素适宜的激发波长，根据其发射谱来确定荧光素检测波长。

常见荧光素的激发及发射波长

可根据荧光素的激发光波长和发射光波长选择光源和滤光片。

荧光标记的应用

荧光标记几乎可以用于所有生物学检测，作为蛋白或抗体标记物可用于ELISA、IF、FCM、WB，蛋白芯片、及活体成像等，作为核酸标记物可用于FISH、基因芯片、qRT-PCR等。荧光标记几乎可以用于从宏观的活体研究到微观的组织、细胞、分子，甚至分子内、分子间作用的所有生物学研究领域。

荧光标记最常见的生物学应用是免疫荧光（IF）和流式细胞术（FCM）。在免疫荧光中，最常用的是靶点胞内定位、示踪及活体分子成像等。

常见胞内定位荧光分子

一、细胞器荧光分子：能渗透到细胞内，选择性地与细胞器结合的荧光物质。可用于细胞器的染色，例如：

线粒体荧光分子——JC-1, Rhodamine 123

溶酶体荧光分子——DAMP, Neutral Red

内质网荧光分子—— Dioc6(3), Dioc5(3), Dioc16(3)

高尔基体荧光分子——NBD Ceramide, BODIPY Ceramide

二、 细胞骨架荧光分子

F-肌动蛋白荧光分子—— BONIPY FL, BONIPY 558/568

G-肌动蛋白荧光分子——DNase I+荧光素（Alexa Fluor 488、Oregon Green 488、Texas Red）

微管蛋白荧光分子——秋水仙减+荧光素、DAPI、DCVJ、Bis-ANS

微管选择性紫杉醇分子——Flutax-2、BODIPY FL Placlitaxel、BODIPY 564/570 、Placlitaxel

三、研究钙调节和活性的荧光分子

钙调蛋白荧光分子——钙的类似物三氯化忒

PKC荧光分子——用BODIPY标记的佛波酯或乙酰辅酶A荧光探针

钙离子荧光分子——Quin-2-AM、Fura-2-AM、Fura-3-AM

四、核酸荧光分子：能以非共价键与DNA/RNA结合，用于DNA/RNA的定性、定量分析。

胞膜透过性核酸荧光分子——用于细胞染色（SYTO、AO、Hoechst、DAPI）

非透过性核酸荧光分子——用于DNA琼脂凝胶电泳（EB和PI、PO-PRO和BO-PRO、AAD、ACMA）

荧光应用举例

一、共定位实验

共定位研究其实是利用不同荧光标记不同的细胞器或亚细胞单位，于是在荧光显微镜下，细胞呈现出绚烂的胞内分区，当标记了荧光的兴趣分子进入细胞后，便可轻松看到其在胞内的定位并可研究其运动轨迹。

案例Ⅰ 利用特定荧光蛋白分别标记过氧化物酶体（Peroxisome）、质膜（PM）和线粒体（Mitochondria），当几张荧光照片叠加（merge）在一起时，就出现了绚烂的细胞分区；

案例Ⅱ 利用绿色、红色和蓝色荧光物质分别对肌动蛋白（actin）、波形蛋白（vimentin）和DNA染色后，即可呈现Hela细胞细胞骨架、中间丝和细胞核区；

案例Ⅲ 再如，利用红色的线粒体荧光素（MitoTracker Red CMXRos）、绿色荧光素连接鬼笔环肽（phalloidin）及蓝色的DAPI，CV-1细胞的线粒体、微管及核区变得层次分明。

二、体外示踪

利用荧光进行实时胞内分子示踪，是细胞动态研究的一个重要方法。

案例Ⅰ 利用特定荧光蛋白分别标记过氧化物酶体（Peroxisome）、质膜（PM）和线粒体（Mitochondria），当几张荧光照片叠加（merge）在一起时，就出现了绚烂的细胞分区；

案例Ⅱ 2018年Cell的这篇报道，更是将活细胞的荧光示踪技术发挥到了极致。科学家团队利用荧光示踪技术，展示了移植的鼠胚胎从单细胞到各胚层形成的全程，展示了各个细胞的发育过程，甚至心脏组织最初的跳动，amazing~

Katie McDole et al. In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. (2018) Cell. Oct 18; 175(3): 859-876.e33.

案例Ⅲ Wang等报道了绿色荧光标记组蛋白（γ-H2AX）后，当细胞经过重金属氧化物处理，细胞发生了DNA断裂（绿色荧光增高）的动态过程，并通过pH敏感的橙色荧光素AO，展示了经处理细胞的溶酶体膜通透性增加，细胞凋亡程度增加。

Histone γ-H2AX用于展示DNA双链的断裂

AO用于展示lysosome的膜不稳定性

Wang Z, et al. Biomimetic nanoflowers by self-assembly of nanozymes to induce intracellular oxidative damage against hypoxic tumors.(2018) Nat Commun. Aug 20;9(1):3334.Rabbit anti-Phospho-Histone H2AX (catalog: bs-3185R, 1:200) was purchased from Bioss.

案例Ⅳ 研究细胞凋亡的一个经典方法是Annexin-V和PI的双荧光标记，利用流式细胞仪可对细胞群凋亡进行定量化研究。Zeng等利用这个方法研究了微小RNA（microRNA-211）对小鼠晶状体上皮细胞所造成的凋亡影响。

Kun Zeng, et al. Effects of microRNA-211 on proliferation and apoptosis of lens epithelial cells by targeting SIRT1 gene in diabetic cataract mice.(2017)Bioscience Reports 37.Rabbit anti-mouse polyclonal antibody SIRT1 (bs-0921R, 1:500), Bcl-2 (bs-20351R), p53 (bs-8687R) were purchased from Bioss.

案例Ⅴ 利用流式细胞术还可以分析细胞或囊泡内成分的变化。例如利用荧光标记脂肪细胞的Shh蛋白，可发现胰岛素耐受病人的脂肪细胞所分泌的外泌体（exosomes）中，Shh蛋白含量高于正常人脂肪细胞的外泌体。

Song M, et al., Adipocyte-Derived Exosomes Carrying Sonic Hedgehog Mediate M1 Macrophage Polarization-Induced Insulin Resistance via Ptch and PI3K Pathways. (2018) Cell Physiol Biochem. 48(4):1416-1432.Antibodies for ADE flow cytometry analysis were purchased from Bioss (Adiponectin-PE, bs-0471R and Shh-FITC, bs-1544R) .

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