炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病，是临床上主要的慢性和复发性肠道炎症疾病。在其他器官（如肝脏）存在异常的IBD患者中，往往存在IBD的严重程度增加，然而，肝脏疾病加重IBD的机制尚未完全了解。在哺乳动物中，肝脏通过色氨酸从头合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺），并将烟酰胺（NAM）释放到血液中，以供外周组织通过NAD⁺补救途径来满足NAD⁺的需求。越来越多的证据表明，NAD⁺代谢在编程肠道结肠炎期间的免疫反应中起作用，但尚不清楚主要循环自肝脏的NAD⁺是否通过调节肠道免疫细胞来影响结肠炎的组织修复。

近期，山东大学齐鲁医院消化内科李石洋教授、左秀丽教授和基础医学院袁得天教授在Advanced Science发表了题为Sensing of liver-derived nicotinamide by intestinal group 2 innate lymphoid cells links liver cirrhosis and ulcerative colitis susceptibility的研究文章，通过代谢组学、单细胞转录组学、基因编辑和骨髓移植等技术手段，揭示了慢性肝病扰乱肝脏NAD⁺代谢，导致经肝-肠轴到达肠道的NAD⁺合成前体物NAM减少，损害肠道2型固有淋巴样细胞（ILC2s）的组织修复功能，继而在并发UC时加重疾病。（麦特绘谱提供¹³C₆-Glucose代谢流检测服务）

研究思路

图1. 技术路线

研究结论

1. 肝损伤和溃疡性结肠炎的症状相关

首先研究了肝损伤对结肠炎的影响，采用回顾性图表分析了UC患者血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平分类的溃疡性结肠炎内镜严重程度指数(UCEIS)，发现肝损伤加重了UC患者的结肠炎症状，两者呈现正相关关系，该结论在四氯化碳（CCL4）诱导和胆管结扎（BDL）肝损伤结合DSS实验性结肠炎小鼠模型中得到验证。

图2. 肝损伤与UC和实验性结肠炎的严重症状相关

2. 肝损伤损害人和小鼠NAD⁺代谢

进一步探索肝损伤加重结肠炎相关的机制，采用非靶向代谢组学对健康供体和肝硬化患者的血浆进行研究，发现有67种代谢物在肝硬化患者中减少，KEGG分析发现辅助因子的生物合成途径变化最大，这是由L-丝氨酸、烟酰胺（NAM）、泛酸和视黄醇水平降低，以及脱氧胆酸3-葡糖醛酸和L-酪氨酸水平的增加造成的。对肝硬化患者血浆NAM进行检测，发现健康人群的NAM水平显著高于肝硬化患者。

RNA-seq数据显示非酒精性脂肪性肝炎和酒精性肝炎患者肝脏样本中，参与NAD⁺从头合成和补救合成途径的关键酶（TDO2、HAAO、QPRT）mRNA水平降低。在肝损伤小鼠模型中进行验证，发现肝脏中Tdo2、Ido2和Kmo的mRNA水平，以及肝脏NAD⁺、血浆NAM和肠道NAD⁺的水平均有所降低。

使用AAV2/8载体携带针对QPRT的mir30-shRNA（Qprt-KD），特异性敲低肝脏中的QPRT基因，成功降低了肝脏NAD⁺、血浆NAM和肠道NAD⁺的水平，在DSS诱导的结肠炎模型中，Qprt-KD小鼠表现出加重的疾病症状，而补充NMN（烟酰胺单核苷酸，NAD⁺前体）能够逆转这一趋势，表明肝脏NAD⁺代谢对结肠炎进展有重要影响。

图3. 肝损伤损害人和小鼠NAD⁺代谢

3. 肝损伤破坏肠道ILC2s

在分子层面继续探索肝损伤加剧结肠炎的机制，采用单细胞转录组学对CCL4处理组小鼠进行研究，发现B/T/ILCs（固有淋巴细胞）减少。通过流式细胞术分析和小鼠模型实验，确认CCl4处理减少了肠道ILC2s产生的效应分子Areg、IL-5和IL-13。将纯化的肠道ILC2s回输到CCl4处理的小鼠中，随后进行DSS处理，发现恢复ILC2s功能能够缓解CCl4加剧的DSS结肠炎。

图4. 肝损伤破坏肠道ILC2s

4. 肠道ILC2s功能维持依赖于NAD⁺补救合成途径

为了评估NAD⁺代谢是否直接调控ILC2s，使用不同的抑制剂来阻断NAD⁺合成的不同步骤，GTN（NMNAT的抑制剂）显著抑制了ILC2s的细胞活性和效应分子的产生，表明NAD⁺的生成对ILC2s的功能至关重要；FK866（NAMPT的抑制剂）显著降低了ILC2s的存活率和细胞因子产生，进一步证明了NAD⁺补救合成途径对ILC2s功能维持的重要性。

图5. 肠道ILC2s维持依赖于NAD⁺补救合成途径

5. NAD⁺调节ILC2s的机制

NAD⁺作为电子受体，在糖酵解和三羧酸循环（TCA）中接受高能电子，最终将这些电子传递给电子传递链（ETC）的复合体I，驱动氧化磷酸化过程，这是细胞产生三磷酸腺苷的主要途径。

ILC2s的SMART测序转录谱显示NAD⁺合成抑制剂FK866处理后，大量基因表达发生变化，特别是细胞周期和氧化磷酸化途径相关基因的下调。进一步的代谢组学分析显示，IL-33激活ILC2s时，NAD⁺及TCA循环中间产物柠檬酸、异柠檬酸、琥珀酸等浓度增加，表明NAD⁺对TCA循环和氧化磷酸化的促进作用。

使用¹³C标记的葡萄糖追踪ILC2s探究NAD⁺是否通过TCA循环代谢产物调控ILC2s，结果显示FK866处理导致ILC2s中丙酮酸和苹果酸积累，减少了琥珀酸及其¹³C标记的同位素体，以及NAD⁺和NADH的含量。补充TCA循环中间产物对NAD⁺和NADH水平无显著影响，但琥珀酸能够部分恢复FK866抑制的ILC2s功能，表明NAD⁺可以通过支持琥珀酸生成来维持ILC2s。

使用丙二酸单乙酯钾盐（EM-K⁺）阻断琥珀酸向ETC的电子传递时，琥珀酸对FK866处理的ILC2s恢复作用被消除，进一步论证了NAD⁺通过支持TCA循环产生的琥珀酸维持ETC，从而保持ILC2s的正常功能。

图6. NAD⁺通过支持琥珀酸盐维持肠道ILC2s

6. NAD⁺以细胞内在方式调节肠道ILC2s

从遗传学的角度进一步探究NAD⁺对ILC2s的调控作用，利用基因编辑技术构建Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠模型，发现表达Areg、IL-5和IL-13的ILC2s数量均有所减少。从Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠中分离出ILC2s，并在体外培养系统中加入IL-2、IL-7、IL-25和IL-33等细胞因子，与野生型对照小鼠相比，Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠来源的ILC2s在数量、存活率以及效应分子产生方面均显著降低。通过添加NMN或琥珀酸治疗，可以恢复这些ILC2s的存活率和功能，支持了NAD⁺通过琥珀酸向电子传递链供电子以维持肠道ILC2s的存活和功能的机制。

通过混合骨髓移植实验进一步证实了NAMPT在ILC2s中的内在作用，来自Nampt^+/+Il5^RFP-Cre（CD45.1/CD45.2）和Nampt^f/fIl5^RFP-Cre（CD45.2/CD45.2）小鼠的骨髓细胞以1:1的比例混合，并转移到Rag2^–/–Il2rg^–/–小鼠中。六周后，从嵌合小鼠的肠道中分离出ILC2s，并通过同系标记追踪其来源。结果显示，来源于Nampt^f/fIl5^RFP-Cre骨髓的ILC2s数量以及产生Areg、IL-5和IL-13的ILC2s数量均较少。

给Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠和同窝对照组喂食DSS, Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠结肠炎更严重，结肠缩短，组织学严重程度增加，添加NMN后症状减轻，此外，NMN也使DSS处理的Nampt^f/fIl5^RFP-Cre小鼠ILC2s数量以及Areg、IL5和IL-13得到恢复。

图7. ILC2s 中NAMPT缺乏可加重DSS诱导的结肠炎

小结

本研究揭示了慢性肝病加重UC的免疫代谢调控机制，发现肠道ILC2s通过感知肝脏来源的NAM来调控UC症状，为治疗伴有慢性肝病的UC患者提供新的免疫代谢靶点。

参考文献

Sensing of Liver-Derived Nicotinamide by Intestinal Group 2 Innate Lymphoid Cells Links Liver Cirrhosis and Ulcerative Colitis Susceptibility. Advanced Science. 2024

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本研究使用麦特绘谱提供的¹³C标记的葡萄糖代谢流检测服务，发现NAD⁺可以通过支持琥珀酸生成来维持ILC2s的正常功能，揭示了NAD^＋调控ILC2s的功能机制。麦特绘谱提供全面的代谢流检测服务，可追踪含¹³C和¹⁵N等被标记物100+种，全面覆盖糖酵解和TCA循环通路、磷酸戊糖途径、 氨基酸代谢、脂肪酸代谢、 一碳代谢、 核苷酸代谢通路等。丰富的个性化标记定制经验–[U-¹³C₆]-Fructose，[U-¹³C₁₆]-Palmitate, [U-¹³C₃]-Serine,[U-¹³C₂]-Glycine, [U-¹³C₃]-Alanine, [U-¹³C₃]-Pyruvate, [U-¹³C₄]Malic Acid, [U-¹³C₁₈]-Oleic Acid, ¹³CO₂, ¹⁵N-NH₄CL, [1, 2-¹³C₂]-Glucose, [2,3,3-D₃]-Serine, [2,3-¹³C₂]Alanine, [1,2,3-¹³C₃]-Choline等。历经数年项目积累，检测各类贴壁细胞、悬浮细胞、菌体、培养液、线粒体、组织、粪便等样本类型，涵盖多发性骨髓瘤、肝癌、线粒体遗传代谢病、免疫细胞活性与疾病、心血管疾病等多个研究方向，合作项目成果突出，文章平均IF >10+。

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