​前言

2022年8月，阿拉巴马大学伯明翰分校Lewis Shi团队在Nature Communications发表“Selective suppression of melanoma lacking IFN-γ pathway by JAK inhibition depends on T cells and host TNF signaling”，该研究利用IFNγR1敲除的黑色素瘤细胞，构建免疫检查点阻断剂（immune checkpoint blocker, ICB）耐药小鼠模型，发现ICB耐药的潜在靶点JAK1/2，其抑制剂以T细胞和肿瘤坏死因子依赖的方式选择性抑制IFN-γ信号缺失的黑色素瘤。

背景介绍

ICB是恶性肿瘤治疗领域的重大突破，尤其是在黑色素瘤中。肿瘤细胞会通过控制免疫检查点蛋白，如CTLA-4、PD-1、PD-L1等，来逃避免疫监视。ICB则通过阻断免疫检查点，在肿瘤浸润T细胞（tumor-infiltrating T cell, TIL）中增强免疫效应功能，并且降低免疫抑制的FoxP3⁺调节性T细胞（T_reg）的丰度，从而实现对肿瘤的抑制。

尽管如此，仍有许多患者对ICB治疗耐受，其中一个主要原因是肿瘤细胞IFN-γ信号缺失，目前尚缺乏针对ICB耐药的治疗策略。肿瘤内IFN-γ信号在ICB抗肿瘤功能中是必需的，但在作者的前期研究中，对黑色素瘤敲低IFNγR1（IFNγR1^KD）却并没有明显改变TIL中CD8⁺/T_reg比例，这可能由于细胞中仍有残余的IFN-γ信号。作者考虑利用CRISPR技术对IFNγR1进行敲除，进而探究克服ICB耐药的潜在靶点。

研究思路

01 构建IFNγR1敲除的黑色素瘤细胞系，以及移植瘤小鼠模型，验证模型能够有效模拟IFN-γ信号缺失导致的ICB耐药。

02 从肿瘤免疫微环境分析ICB耐药，检测IFN-γ信号缺失对TIL的影响，发现IFN-γ信号缺失使肿瘤内T细胞特征减少。

03 利用激酶组分析寻找可能的ICB耐药靶点，发现IFN-γ信号缺失的黑色素瘤细胞中JAK1/2激酶通路的激活。

04 分别从胞外和胞内探究JAK1/2通路激活的因素，找到PI3K-Akt和mTOR信号通路，通过不同抑制剂处理等证明mTOR在上游调控JAK1/2通路。

05 体内验证JAK1/2抑制剂可以通过T细胞和TNF因子依赖的方式特异性阻碍IFN-γ信号缺失的黑色素瘤生长。

研究内容

首先，作者利用CRISPR-Cas9技术在B16细胞中敲除IFNγR1（IFNγR1^KO），并接种至BL6小鼠中构建黑色素瘤小鼠模型。经验证IFNγR1^KO细胞对IFN-γ的刺激没有响应，表现为JAK2磷酸化、Irf1、PD-L1、MHC-I/II等在IFN-γ刺激下均没有上调，此外IFN-γ也不能诱导IFNγR1^KO细胞凋亡或抑制其细胞增殖。IFNγR1的敲除本身对B16细胞体内成瘤能力没有影响，但IFNγR1^KO黑色素瘤对CTLA-4抗体的处理耐受。与体外数据一致，体内IFNγR1^KO黑色素瘤经CTLA-4抗体治疗后，PD-L1和MHC-II等表达也没有上调。

接下来作者分析IFNγR1^KO黑色素瘤中的TIL表型。流式发现CD8⁺ T细胞的基数减少，并且CTLA-4抗体治疗不会像对照黑色素瘤那样，增加T细胞浸润、减少瘤内T_reg细胞比例、或促进效应细胞因子分泌等等。对TCGA数据库中黑色素瘤进行分析，按照IFNGR1表达量分为两组，发现IFNGR1低表达的黑色素瘤中T细胞特征基因表达降低，包括T细胞表面标志物、效应分子和MHC分子等，同时IFNGR1低表达的黑色素瘤患者生存率也显著降低。相比于皮肤黑色素瘤（SKCM），葡萄膜黑色素瘤（UVM）对免疫检验点抑制剂（ICB）更加耐受，数据库表明UVM中IFNGR1表达，以及T细胞特征基因表达更低。

考虑到酪氨酸激酶在IFN-γ信号中的重要作用，作者对IFNγR1^KO细胞进行了激酶组活性分析，试图在其中寻找克服ICB耐药的靶点。这一分析发现激活的激酶网络汇集到JAK1/2，WB验证IFNγR1^KO细胞JAK1/2及其下游STAT3的磷酸化水平升高，而在IFNγR1^KO细胞重新表达Ifngr1后，JAK1/2磷酸化水平回调，说明黑色素瘤中IFN-γ信号的缺失与JAK1/2异常激活存在联系。

JAK-STAT通路可能由胞外信号如IFN-γ、IFN-α/β、IL-6等激活。Il6、Il6r以及IFNαR1（IFN-α/β受体）在IFNγR1^KO细胞中表达升高，但IL-6和IL-6R抗体处理，或敲除Ifnar1均不能使IFNγR1^KO细胞的JAK1/2磷酸化水平降低，说明不是这些因素使JAK1/2激活。进一步分析其他胞外因素，作者用IFNγR1^KO细胞的培养基上清处理对照黑色素瘤细胞，发现并不能诱导JAK2磷酸化水平上升，因此IFNγR1^KO细胞JAK1/2的激活更可能是胞内事件的结果。

为了明确使JAK1/2的激活胞内因素，作者对IFNγR1^KO和对照细胞进行了全转录组测序，利用差异表达基因进行通路富集分析，并且进行了磷酸化蛋白质组学研究。这些分析均发现PI3K-Akt和mTOR信号通路的显著差异，WB验证了IFNγR1^KO细胞中AKT和4E-BP1（mTOR下游）磷酸化水平升高。作者进一步研究JAK1/2与mTOR通路的关系。mTOR抑制剂rapamycin (Rapa)处理IFNγR1^KO细胞显著抑制JAK2磷酸化，而JAK1/2抑制剂ruxolitinib (Ruxo)处理后4E-BP1磷酸化水平不变，并且在IFNγR1^KO细胞中敲低mTOR也能使JAK1/2磷酸化回调。因此，在IFN-γ信号缺失的黑色素瘤细胞中，mTOR通路信号增强，并调控下游JAK1/2的激活。

上述结果提示IFN-γ信号缺失导致的ICB耐药或许可以通过靶向mTOR-JAK1/2来解决，作者随后在B6小鼠中进行体内验证。在用Ruxo分别处理IFNγR1^KO和对照黑色素瘤小鼠模型后，发现Ruxo仅特异性抑制IFNγR1^KO黑色素瘤生长。尽管如此，体外实验表明这一抑制作用并非由Ruxo对IFNγR1^KO细胞的直接杀伤所致。对体内黑色素瘤的分析显示，Ruxo能够减少CD4⁺ TIL中T_reg细胞比例，增加TNF、IFN-γ、穿孔素、IL-2的分泌。而从未经药物处理的黑色素瘤中分离TIL进行体外培养，发现Ruxo处理降低FoxP3表达，增强TIL的效应功能。以上结果表明Ruxo依赖于TIL发挥对IFN-γ信号缺失的黑色素瘤的抑制作用，而非直接杀伤肿瘤细胞。

为了评估T细胞在Ruxo治疗中的作用，作者对接受Ruxo治疗的IFNγR1^KO黑色素瘤小鼠进行CD4或CD8中和抗体处理，发现任一种T细胞的缺失都使Ruxo的治疗无效。在对Ruxo抑癌效应机制的探究中，作者关注到TNF。IFNγR1^KO黑色素瘤细胞接种至TNF敲除（TNF^-/-）小鼠后，Ruxo不能将其抑制。对TIL的分析也发现，TNF^-/-小鼠中Ruxo处理不能使T_reg细胞比例下降，或使IFN-γ、IL-2等因子分泌增加。因此，Ruxo对IFNγR1^KO黑色素瘤的特异性抑制依赖于T细胞和TNF因子。

综上所述，文章利用IFNγR1敲除的黑色素瘤小鼠模型，发现IFN-γ信号缺失的黑色素瘤免疫微环境更不利于抑制肿瘤；结合激酶组、转录组、磷酸化蛋白质组等多组学分析，发现此类黑色素瘤中mTOR通路信号增强，从而激活下游JAK1/2激酶；JAK或许可以作为IFN-γ信号缺失所致ICB耐药的靶点，对临床有一定的指导意义。

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