随着个体化医学的发展和"精准医学"概念的提出，肿瘤药物治疗发展迅速，临床研究逐渐发现并证实更多与药物治疗疗效预测相关的基因突变。传统的基因突变检测方法如Sanger测序、焦磷酸测序和实时荧光PCR等仅能对单个基因，或者单个基因的部分外显子突变进行检测，采用上述传统基因突变检测方法同时检测多个基因，一则需要的样本量大，其次需要更长的检测时间和更大的工作量。高通量测序（HTS）即下一代测序（NGS），能够同时对上百万甚至数十亿个DN**段进行测序，可实现在较低的成本下，一次对多至上百个肿瘤相关基因、全外显子以及全基因组进行检测，而且需要的样本量并不增加。因其在通量、成本和效率方面的优势，NGS在实体肿瘤体细胞基因突变中展现了其广阔的应用前景。
NGS检测流程复杂，对实验室环境条件、人员能力及质量管理要求高。实体肿瘤体细胞基因突变NGS检测中，低频突变、肿瘤异质性、样本种类多样、样本质量差别较大等均给实验室检测带来了挑战，因此其在方法建立、分析前、中、后质量控制等方面均有其特殊之处。
实体肿瘤体细胞基因突变NGS检测实验室建设的总体要求
实验室分区
实体肿瘤体细胞突变检测通常分析敏感性较高，临床实验室应尤其注意合理分区，以防止污染。杂交捕获法NGS建议的分区包括试剂准备区、样本制备前区、样本制备区、打断区、电泳区、文库制备区、扩增一区、杂交捕获区、扩增二区和测序区。但是不同检测流程，分区设置有所不同，临床实验室应根据"通用共识"的"32字原则"来考虑实验室分区设置。若实验室同时检测血浆和组织或细胞学两类样本，则需设置不同的样本制备区及其后续的文库制备过程中的相应区域。
实验室人员及能力要求
NGS实验室负责人或技术负责人应有全面的NGS及其实验室质量管理知识。采用组织样本进行检测的实验室，"湿实验"团队成员应包括病理医（技）师人员。生物信息学分析团队中应有具备临床肿瘤学和临床分子检测基本知识的人员。签发报告人员应具备医学分子生物学和临床肿瘤学知识背景，熟练使用相关数据库，掌握本领域的指南，了解相关研究的最/新进展。对于疑难病例或必要时，可由不同专业的专家组成的分子肿瘤专家组给出个体化治疗方案。使用LDTs的实验室，应配备"湿实验"和"干实验"研发人员，其应具有正确设定肿瘤体细胞突变NGS检测临床预期用途、建立检测系统（含试剂配制和生物信息分析流程搭建等）及其使用SOPs以及完成LDTs性能确认的能力。
肿瘤基因突变NGS检测流程的建立与质量保证
实体肿瘤体细胞基因突变NGS检测的临床预期用途为通过体细胞基因突变检测选择可能在靶向或免疫治疗药物使用中受益的患者以及耐药监测。临床实验室应在预期用途中包括但不限于适用人群、样本类型、检测基因及其突变位点或突变类型和检测的临床意义等。
在NGS方法学建立和优化阶段，实验室需根据临床预期用途，选择具有临床意义的待测基因位点；优化核酸提取方法，所提取核酸的质量应满足检测要求；建立和优化文库制备方法；对测序平台进行性能确认，建立测序平台检测不同突变类型的性能指标；搭建和优化生物信息学分析流程，确定测序深度和阳性判断值，并对生物信息学分析流程进行性能确认。
1. 待测基因位点的选择
需根据检测目的，依据医学科学证据选择待测基因位点。检测panel的大小决定了测序成本、实验室检测工作量以及分析和临床解释的复杂性，实验室应合理选择基因和panel大小。
2. 核酸提取的建立和优化
实验室需根据待检样本类型选择核酸提取试剂，不同样本类型对核酸提取试剂要求不同，实验室可使用商业化的提取试剂盒、设备或已经过确认的自建核酸提取方法。使用前，应对拟采用的试剂或设备进行评估，评估是否适用拟检测的癌种和样本类型。实验室需确认核酸提取的重复性、提取效率、提取纯度及不同大小核酸片段提取的偏好性（必要时）等方面。
3. 文库制备的建立和优化
实验室需确认文库制备流程可以产生满足检测要求的文库（文库浓度、文库片段大小等），评估交叉污染发生率，必要时通过特异双端标签建库策略以及合适的生物信息学分析流程降低污染。
4. 测序平台的性能确认
实验室应优先选择NMPA批准的测序平台，并根据所选定的基因panel，并综合考虑测序通量、测序数据准确度、可支持读长、运行时间、测序成本等选择测序平台型号。对已知不同突变类型的样本进行检测，建立测序平台检测不同突变类型的性能指标（如精密度、准确度），并明确所用测序平台是否满足临床预期用途。
5. 生物信息学分析流程的搭建与性能确认
在生物信息学分析流程搭建和优化过程中，实验室应确定测序深度和阳性判断值（cut-off）。测序深度和阳性判断值密切相关，即适宜的测序深度需在已知阳性判断值的前提下方可确定；而合理的阳性判断值也需在一定的测序深度条件下明确。
实验室应根据所检测的突变类型，选择合适的算法和软件，提高对肿瘤基因突变检测的敏感性。不同软件或算法识别某种变异类型的能力有所不同，应采用多种算法，以提高不同突变类型的检出准确率。另外还应建立完善包括数据质控与过滤、数据比对、变异识别和变异注释在内的生物信息学数据分析流程、软件及数据库。
性能验证或性能确认
使用NMPA批准的NGS试剂进行检测前应进行分析性能验证；LDTs试剂应根据临床预期用途进行试剂方法的设计和优化，至少要对体细胞基因突变的识别策略、样本前处理、核酸提取、文库制备、靶向捕获、高通量测序平台、生物信息学分析、测序深度和阳性判断值等环节进行确认。
在完成试剂方法的设计和优化后，实验室应对LDTs检测的全流程进行整体的性能确认。分析性能确认应至少证明NGS对各种不同突变类型的检测能力，证明对重要常见基因的检测能力。
如果临床实验室可接收多个样本类型，那么对每种样本类型均需分别进行性能确认。没有足够的临床样本，可以使用模拟样本来代替。
分析性能确认包括但不限于精密度、准确度、分析敏感性、分析特异性和可报告范围等。在确认分析性能特征可以满足临床预期用途后，最终完成建立"湿实验"试剂配制和"干实验"生物信息学分析流程SOPs。
对预期用途为伴随诊断的NGS检测需进行临床性能确认。性能评价应包含检测范围内样本类型和突变类型。通过性能评价，建立性能参数，明确检测的局限性。若实验室流程发生改动，需根据对检测的影响进行全面或部分性能确认。
实验室检测SOPs的建立
分析前
实验室应制定每一种类型样本采集、运送、接收和保存的SOPs，明确样本接收和拒收标准，建立合适的样本运输和保存要求。适用于肿瘤基因突变NGS检测的样本主要包括FFPE、血浆、新鲜组织、胸腹水等。
采用FFPE、胸腹水细胞沉淀或新鲜组织进行NGS检测前，需先评估样本质量和肿瘤细胞的含量。为避免交叉污染，切片制备过程中，应使用一次性耗材。血浆样本采集、运送、接收和保存的核心是避免外周血有核细胞裂解释放基因组DNA稀释游离DNA或游离DNA降解。
分析前记录的关键点为样本接收、拒收和预处理的记录。当样本质量未达到SOPs要求时，可进行让步检测，但应建立对应的异常情况处理程序。
分析中
实验室应根据性能确认或性能验证的结果，建立分析中检测的标准操作程序。各环节的质量标准是标准操作程序的重要组成，包括核酸提取后，核酸浓度、核酸纯度和核酸的片段分布要求，文库制备的DNA上样量和文库制备后进行杂交捕获上样量的要求，最低测序深度、平均测序深度、覆盖均一性、GC含量、碱基识别质量值、比对质量值和在靶率等要求，这些要求也同时是分析中实验记录的关键点。若某一关键环节的检测质量控制参数不符合要求，则实验室应根据所建立的异常情况的处理程序进行处理。
此外，实验室应根据可检测的样本类型、突变类型、检测下限等设置合适的包括所检测的所有突变类型的弱阳性、阴性和无模板对照（如水样本）质控品，且与待检样本同批检测。
定期参加EQA/PT或进行实验室间比对等。出现失控，应分析失控原因，并采取相应的纠正措施和预防措施。
分析后
实验室应对体细胞基因突变药物疗效预测的临床意义进行解释。实验室应制定结果解释的SOPs，并遵循准确、及时和充分的原则。在需要的情况下，临床实验室应给出进一步检测的建议。由于样本质量或其他质量要求未达到，但样本有限的情况进行的让步检测，也应在报告中进行说明。与肿瘤无关的意外发现因难以解释，建议不在检测报告中进行呈现。在对如结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等具有遗传倾向的肿瘤进行NGS检测时，需结合家族史，考虑是否为遗传性肿瘤，并建立遗传咨询流程。
NGS技术在肿瘤的精准诊疗中具有重要作用，实验室应加强质量管理，保证NGS检测结果的准确性。本共识对实体肿瘤体细胞基因突变NGS检测中的临床预期用途确定、方法建立与优化、LDTs性能确认、分析前中后的质量保证关键环节进行了阐述。
目前，实体肿瘤基因突变NGS突变检测主要用于肿瘤靶向用药指导及其耐药监测和免疫治疗疗效评估。随着发展，新的生物标志物将不断出现，新的NGS测序技术不断进入临床检测，预期用途还会进一步扩大。
菁良解决方案
菁良多种标准品/质控品能够应用于检测的日常质控、EQA/PT以及LDT性能确认，对于整个NGS检测流程，从核酸提取→文库制备→测序→数据/结果分析，可以全流程监控检测分析，并验证检测结果的精确性和特异性。
泛肿瘤800gDNA标准品
▷ 样本来源于人类细胞系
▷ 覆盖多种癌症有关变异位点
▷ 验证位点多（大于320个基因、720个突变）
▷ 变异类型全
▷ 变异位点多为已知数据库位点
▷ 突变位点频率范围宽(1-100%)
▷ ddPCR验证位点突变频率呈梯度(1-7%)
▷ 变异位点分布范围广
▷ 多种平台验证变异位点
▷ 全外显子测序采用业内公认度极高的捕获芯片及测序平台
▷ 涵盖位点包含多个国际知名肿瘤检测Panel
FFPE标准品
▷ FFPE蜡块或切片
▷ 样本来源于人类细胞系，最/大程度模拟患者FFPE样本
▷ 数字PCR平台验证变异位点
▷ 产品包含DNA及RNA两种形式
▷ 包括ALK,ROS1,RET,NTRK等融合基因
▷ 突变来源于非小细胞肺癌NCCN指南推荐的基因
肺癌ctDNA标准品套装
▷ 样本来源于人类细胞系
▷ 变异位点频率经过数字PCR平台验证
▷ 套装包含三管产品，对应三个AF梯度：0，0.1%，1%
▷ 涵盖8个非小细胞肺癌热门基因突变位点
▷ 标准品平均片段长度为160bp，最/大程度模拟循环肿瘤DN**段分布
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参考资料：北京市临床检验中心, 北京医学会检验医学分会, 首都医科大学临床检验诊断学系, 等. 高通量测序技术临床规范化应用北京专家共识（第一版肿瘤部分） [J] . 中华医学杂志,2020,100 (09): 648-659. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2020.09.003