细胞疗法在治疗复杂疾病方面有着无可争议的贡献。随着越来越多的这类疗法得到上市许可，其涉及到的生物工艺也越来越受到人们更多的关注，最近来自细胞与基因疗法制造中心的B Marc-Olivier等人的研究中，使用拉曼光谱作为在线光学传感器，检测一个自体T细胞免疫治疗模型的生物工艺过程，该过程在一个生物反应器中进行。通过使用标准生物学分析方法测定参考数据，开发了基于拉曼光谱的化学计量学模型，用于测定葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸盐和氨的含量，使得对过程性能进行即时反馈成为可能。
介绍
在细胞疗法生物过程中，根据设计质量原则（QbD）开发工艺。QbD的一个关键促成因素是实施过程分析技术（PAT），在这里，作者展示了拉曼光谱在生物反应器系统中监测T细胞培养的应用。通过化学计量学建模，以in-line的方式实时追踪代谢过程的多个标记物，并与以at-line方式测量的质谱和生物分析技术的测量结果相关联。这些结果显示，在细胞疗法生物过程中实时在线监测的发展已经向前迈出了重要一步，这为提高细胞疗法生物过程的一致性开辟了新的机会。
材料和方法
图1 ：RamanRxn2原位收集拉曼光谱分析仪
来自四名健康献血者的新鲜的外周血，分离CD4+/CD8+细胞的阳性T细胞，采用300ml微型生物反应器系统中进行T细胞活化和扩增。在每个实验中，来自四个不同供体的T细胞库平行培养12天。使用相同的四个T细胞库进行了总共三次实验。每天对生物反应器进行取样测量葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和氨浓度的离线参考数据。
拉曼光谱用RamanRxn2原位收集拉曼光谱分析仪采集（参见图1），配有四个不锈钢浸入式探头。拉曼探头通过高压灭菌进行消毒。激光器激发波长为785 nm，功率为400 mW，分辨率4cm-1。的光谱收集间隔：进行75次扫描，每次扫描10秒。
结果
所有T细胞培养物在 300 mL生物反应器中保持12天，该反应器包含拉曼光谱探头和pH传感器、温度传感器和DO传感器。这些过程持续12天，第7天最后一次补料，以检查细胞对耗尽的营养的反应。为了证明初代细胞材料常见的变异性，对来自四个独立供体的白细胞分离材料进行T细胞计数，并在T细胞分离前后对CD4和CD8群体进行计数，供者之间输入材料中的总T细胞计数在1.42×109到2.89×109之间变化。根据离线数据和模型输出之间的相关性，对最佳模型拟合进行了如下排序：葡萄糖（R=0.987）、乳酸（R=0.986）、氨（R=0.936）、谷氨酰胺（R=0.922）和谷氨酸（R=0.829）。葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺的化学计量学模型与参考数据很好地相关，并准确预测了从第5天细胞代谢和增殖率开始增加以后，葡萄糖和谷氨酰胺的消耗和乳酸的产生。将与离线测量相关的误差评估变异系数（CV）。葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺，谷氨酸和氨的CV分别为0.9%、1.1%、1.2%， 3.7%，和1.7%。细胞浓度的变异系数为4.0%，细胞活力的变异系数为1.3%。因此，在随后的分析中观察到的所有趋势都是显著的。拉曼化学计量学模型以良好的相关性跟踪参考测量值，并显示了该技术作为PAT传感器的潜力（参见图2，图3）。
图2 ：葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和氨的化学计量学模型，显示每24小时收集的参考生物分析仪测量值与连续拉曼化学计量学分析之间的相关性。显示了所有四个供体的单个生物培养过程的数据。
图3 ：与匹配的单变量拉曼模型相比，所有供体和所有运行的细胞浓度和活力的离散时间过程数据。
讨论
生物反应器系统用于细胞治疗的生物培养过程中，提供在线传感器，可用于常规实时监测物理参数，如pH、溶解氧和温度。然而，在培养系统中测量与细胞行为相关的生物学和功能参数要复杂得多。在本研究中，作者应用在线拉曼光谱作为光学传感器，实时监测免疫治疗生物过程中T细胞的代谢和增值。其主要目的是证明利用拉曼光谱监测营养物质（葡萄糖、谷氨酰胺）的消耗和与细胞代谢相关的标记物（乳酸、谷氨酸和氨）的产生是可行的。
本研究中提供的数据证明了在细胞疗法生物过程中使用拉曼光谱仪实时监测细胞功能行为的潜力。这是第一份应用拉曼技术监测细胞疗法生物模型中营养消耗和代谢物产生的报告。对这些关键参数进行实时测量的能力可以提供对工艺性能的即时反馈，并使拉曼光谱仪成为改进未来细胞治疗制造工艺的一个有吸引力的PAT系统。
参考文献
[1] Marc-Olivier, B. , Daniela, B. , Enas, H. , & Damian, M. . (2018). Application of raman spectroscopy and univariate modelling as a process analytical technology for cell therapy bioprocessing. Frontiers in Medicine, 5, 47.