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3D打印高分辨率图案化细胞结构

作者：上海睿度光电科技有限公司 2021-09-15T00:00 (访问量:2109)

生物打印是一种用于制造活组织的新兴技术，它允许将细胞排列在预定的3D结构中。然而，包含多种细胞类型的高分辨率生物打印结构的例子有限。一种低成本工艺被提出，该工艺采用含有哺乳动物细胞的液滴的3D打印，以在油中产生坚固的、有图案的构造，并将其可重复地转移到培养基中。以组织相关密度（10⁷个细胞/mL) 和1nL的高液滴分辨率。打印出具有≤200μm特征的高分辨率3D几何图形；这些包括一个树枝状细胞连接、一个对角平面连接和一个骨软骨界面。打印的细胞显示出高活力（平均90%），打印结构内的HEK细胞在培养条件下增殖。值得注意的是，一项组织工程研究表明，打印的oMSCs可以沿软骨细胞谱系分化，以产生含有II型胶原蛋白的软骨样结构。

大多数组织由多种细胞类型组成，这些细胞类型以细胞间通讯和功能所需的3D排列方式组织。体外活组织的制造涉及重现这种复杂的细胞结构，这很难以受控方式进行。然而，现在的细胞打印技术和3D细胞培养技术的发展使得简单组织能够从打印的细胞构建体成熟，这些细胞构建体是一种或多种细胞的3D组织。具有生理形态和复杂性的人造组织已用于外科植入、毒理学和肿瘤模型。在“High-Resolution Patterned Cellular Constructs by Droplet-Based 3D Printing”的研究中，研究团队将以前用于3D打印具有组织样功能的水滴网络的方法扩展到活细胞的高分辨率图案。此外，这种低成本方法能够在组织相关细胞密度下重复打印具有高细胞活力的3D构建体，液滴分配体积低至1nL，即液滴分辨率介于传统喷墨打印机和基于阀门的生物打印机之间。

研究团队使用了一种单液滴具有1nL液滴分辨率的高精度细胞打印方法（这种生物打印方法，通常可以利用Inkjet技术或者EHD喷墨打印技术来实现，这两种打印方法，RUIDU都可提供高精度的打印系统，以及成熟的技术支持）。浸入油中的打印细胞结构随后被封装在凝胶薄层中，以转移到水性介质中。通过这种方式，研究团队从两组细胞中生成了图案结构，具有高分辨率3D特征，包括宽度低于200μm的层和通道，在坚固的立方毫米尺度结构内。掺入的细胞最初显示出高活力（平均90%）并且以10⁷个细胞/mL的组织样密度存在，即与基于液滴的生物打印过程的最高报告密度相同。细胞增殖发生在几天内，同时细胞活力总体增加（平均>95%）。值得注意的是，打印结构中的绵羊间充质干细胞（oMSCs）对转化生长因子-β3（TGF-β3）有反应并经历分化以形成软骨样结构。这些数据表明，基本的生物过程在打印后可以保持完整，表明这里介绍的方法将适用于复杂的组织制造。

细胞结构的3D打印

细胞结构的高分辨率制造是通过使用3D打印机实现的，该打印机以前用于打印被油中脂质单层包围的水滴。打印机修改允许加载在液滴内的哺乳动物细胞在基于水凝胶的生物墨水中进行图案化（图1和2，方法）。然后将打印的细胞构建体封装在凝胶薄层中以允许转移到水性介质中（图3）。选择人胚肾（HEK-293T）细胞衍生物（补充方法）来评估打印方法，而oMSCs用于研究打印构建体中细胞的分化能力。

▲ 图1 细胞结构的3D打印。（a）细胞打印示意图。分配喷嘴将含有细胞的生物墨水液滴喷射到含有脂质的油中。油滴通过油容器的程序运动定位。液滴通过形成液滴界面脂质双层而凝聚。（b）共聚焦荧光显微照片显示无细胞打印结构内的液滴界面双层（染成黄色）（11×14×7个液滴）。通过向打印溶液中添加sulforhodamine-101（~10μM）来观察双层。（比例尺=100μm）。（c）直方图显示油下打印液滴中的平均HEK-293T细胞密度作为生物墨水中细胞密度的函数。细胞密度计算为每个液滴的平均细胞数（n=25）除以平均液滴体积。误差棒代表液滴尺寸方差和每个液滴方差的单元格的复合误差。（d）包含两种细胞类型的图案化细胞结的明场显微照片，打印为从两个玻璃喷嘴（d=~150μm）喷出的1nL 液滴（d=130μm）的连续层。（e）油下打印的HEK-293T细胞构建体（11×14×2液滴）的共聚焦荧光显微照片。分别用钙黄绿素-AM（CAM，绿色）和碘化丙啶（PI，红色）进行活/死细胞染色。可见大约700个细胞，4×10⁷个细胞/mL，存活率为85%（通过手动细胞计数确定）。（比例尺=150μm）。（f）在HEK-293T细胞构建体（7×8×4液滴）上进行的活/死测定的高倍放大共聚焦荧光显微照片，打印起始浓度为1.5×10⁷个细胞/mL，平均占用率每滴38个细胞相当于3×10⁷个细胞/mL。可以看到一些液滴边界。（比例尺=75μm）。

▲ 图2 两种细胞类型的高分辨率图案。（a-c, e,f）打印后立即在油中打印细胞结构的共聚焦荧光显微照片。用深红色（DR）或红色 CMPTX（RC）CellTracker™染料染色的HEK-293细胞分别呈蓝色和黄色假色。（a）方形结构内的Y形结构（8×9×4个液滴），平均特征宽度为180μm。（比例尺=200μm）。（b）方形结构内的HEK-293细胞的十字形图案（10×12×5个液滴）。（比例尺=250μm）。（c）（b）中图案化HEK-293细胞的高倍放大图像。（比例尺=100μm）。（d）立方体细胞结构的3D模型，在x-z平面的对角线上具有两个HEK群体（HEK 1，黄色；和 HEK 2，青色）之间的界面。（e，f）根据（d）中的模型打印的细胞构建体（21×24×7个液滴）在固定垂直位置（分别为45和192μm）的部分横截面，显示了两个HEK群体。（比例尺=250μm）。（g-j）层状结构的侧面图像，包括相转移前后的CellTracker™染色的HEK-293细胞。下部DR染色的HEK-293细胞层（黄色）为3滴厚，而上部RC染色的HEK-293细胞层（蓝色）为4滴厚（g,h）或3滴厚（i ,j）。记录图像：（g）在第0天，在油中，打印后立即；（h）转移到培养基后立即；（i）在培养基培养的第3天；（j）在培养的第5天，在培养基中。（比例尺=250μm）。

▲ 图3 含有HEK-293T细胞的打印结构的相转移和培养。（a）打印结构的凝胶封装和相转移。通过在4°C下静置20到25分钟使打印的细胞构建体凝胶化，并通过在室温下用硅油AR20洗涤去除油中的脂质。然后将构建体涂上一层薄薄的无细胞生物墨水，通过在4°C下静置20到25分钟使其凝胶化。然后将凝胶化的构建体转移到油培养基两相系统的上相中。构建体通过油落入培养基中。（b）在油下打印后立即打印为长方体结构（7×8×4液滴）的活/死染色HEK-293T细胞的z-stack 3D重建图像。打印液滴的平均密度为2.9×10⁷个细胞/mL，存活率为96%。（比例尺=200μm）。（c）凝胶封装并转移到培养基后活/死染色打印HEK-293T细胞的z-stack 3D重建图像。（比例尺=200μm）。（d）图表显示了在转移到培养基后第0天五个打印构建体的HEK-293T细胞活力（包括平均值的标准误差）。通过使用自动对象计数来确定生存力，其值使用未经修改或相对于平均细胞大小解析。（e）第7天在培养基中的构建体上进行的免疫细胞化学z-stack 3D重建图像：细胞核（DAPI，蓝色）；活细胞的细胞质（CAM，绿色）和；有丝分裂标记（磷酸组蛋白H3 ICC、PH3、白色）。（比例尺=200μm）。

由于构建体是在油中组装的，因此液滴以六边形阵列堆积。相比之下，当在空气中打印液滴时，它们会变平，并且在水平面上的打印分辨率会降低。构建体可以用高浓度的细胞打印，而不会出现明显的聚结或结构保真度的损失，这归因于Fmoc-二肽的掺入和生物墨水中胎牛血清（FBS）的省略。为了在凝胶封装和相转移过程中稳定构建体，生物墨水补充有琼脂糖（1.0至1.2w/v%），使打印的图案保留在固化的水凝胶中。Fmoc-二肽的存在还通过增加打印液滴之间的界面粘附力来帮助图案保留，从而产生更具凝聚力的结构。

参考文献：

[1] Graham A , Olof S N , Burke M J , et al. High-Resolution Patterned Cellular Constructs by Droplet-Based 3D Printing[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1).

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