T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)

中文名称：T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)
英文名称：T4 Polynucleotide Kinase
产品规格：100U|500U
本酶是一种多聚核苷酸5羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3磷酸基团的单核苷酸的5羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应：5-OH + NTP → 5-P + NDP。

上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下，T4 Polynucleotide Kinase可以显示出5***酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3磷酸基团的单核苷酸的5磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其他NTP也可产生相同的反应：5-P + NDP → 5-OH + NTP(最适pH为6.4左右)。

当ATP和ADP都适量存在时，T4 Polynucleotide Kinase可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3磷酸基团的单核苷酸的5磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。其他NTP也可产生相同的反应：5-P + NTP + NDP→5-P + NDP + NTP。T4 Polynucleotide Kinase同时具有3***酶活性，可催化3磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3-P → 3-OH + Pi(最适pH为5.9左右)。T4 Polynucleotide Kinase的激酶活性在C-末端附近，而***酶活性在N-末端附近。

产品组份：
T4 Polynucleotide Kinase(10U/μl) ——————100U
Reaction Buffer A(10X)————————————80μl
Reaction Buffer B(10X)————————————40μl
24% PEG Solution———————————————40μl

用途：寡核苷酸、DNA或RNA的5末端标记，用作Southern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；催化3磷酸化的单核苷酸的5磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3末端连接；去除3端磷酸基团。
来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。
活性定义：37℃30分钟内，将转移ATP上1 nmol γ-磷酸基团转移到DNA 5-OH末端所需的酶量定义为1个活性单位。
酶活性检测条件：100mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgCl2，5mM DTT，0.5mM 5-OH DNA，0.05mM ATP，0.1MBq/ml [γ-33P]-ATP。
纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。
酶储存溶液：20mM Tris-HCl(pH7.5)，25mM KCl，0.1mM EDTA，2mM DTT，50% glycerol。
Reaction Buffer A(10X)(用于磷酸化反应)：500mM Tris-HCl(pH7.6 at 25℃)，100mM MgCl2，50mM DTT，1mM spermidine，1mM EDTA。
Reaction Buffer B(10X)(用于交换反应)：500mM imidazole-HCl(pH6.4 at 25℃)，0.18M MgCl2，50mM DTT，1mM spermidine，1mM EDTA，1mM ADP。
失活或抑制：75℃加热10分钟可使T4 Polynucleotide Kinase失活，加入EDTA也可使T4 Polynucleotide Kinase失活。金属离子螯合剂、磷酸盐、铵根离子、大于50mM的KCl和NaCl均可显著抑制T4 Polynucleotide Kinase的活性。
储存条件：-20℃。

注意事项：
1. 铵盐沉淀获得的DNA不能用于T4 Polynucleotide Kinase的标记反应。铵盐可强烈抑制T4 Polynucleotide Kinase的酶活性。
2. PEG可促进磷酸化反应速率和效率；交换反应体系应加入PEG。

使用说明：
1. DNA 5 末端标记：
a. 参考如下表格设置反应体系：
待磷酸化DNA—————————————————1~20pmol (5 末端)
Reaction Buffer A (10X)———————————2µl
[γ-32P or γ-33P]-ATP (3,000Ci/mmol)————20pmol
补充无核酸酶的去离子水 ———————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)——————1µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀，以终止反应。
e. 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。

2. DNA 5’ 末端磷酸化：
a. 参考如下表格设置反应体系：
待磷酸化DNA————————————————1~20pmol (5 末端)
Reaction Buffer A (10X)——————————2µl
0.1mM ATP—————————————————1µl
补充无核酸酶的去离子水 ——————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)—————1µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀，以终止反应。
e. 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。

3. 通过交换反应(exchange reaction)进行DNA 5 末端标记：
a. 参考如下表格设置反应体系：
待磷酸化DNA——————————————————1~20pmol (5 末端)
Reaction Buffer B (10X)————————————2µl
[γ-32P or γ-33P]-ATP (3,000Ci/mmol)—————40pmol
24% PEG Solution ———————————————4µl
补充无核酸酶的去离子水 ————————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)———————1µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀，以终止反应。
e. 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。

4. 其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。 

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！