Y2HGold 酵母感受态细胞 Y2HGold Chemically Competent Cell

产品规格: Y2HGold 10×100μl 保存条件：-80℃ PGADT7（control vector） 10ng/μl 10μl 保存条件： 4℃ Carrier DNA 5ug/μl 100 μl 保存条件： -20℃ PEG/LiAc 3.5 ml 保存条件： 4℃ MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS–Gal1TATA– His3, GAL2UAS–Gal2TATA–Ade2 URA3 : : MEL1UAS–Mel1TATA AUR1-C MEL1 Y2HGold 菌株是 Clontech 公司开发的 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa 型，可直接转化质粒或 与 MATα型酵母菌株 Y187 通过 mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。 Transformation marker 为: trp1, leu2，报告基因为：AbAr, HIS3, ADE2, MEL1。 Y2HGold -GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7 和 PGADT7。 质粒 PGBKT7 的筛选标志为 TRP1，用于表达 DNA-BD(来自酵母转录因子 GAL4N 端 1~ 174 位氨基酸) 与目标蛋白(Bait)的融合蛋白； 质粒 PGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白（Prey） 的融合蛋白。 GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子 GAL4 可分为功能上相互独立的两个结构域：位于 N 端 1 ~174 位氨基酸区段的 DNA 结合域（DNA-BD）和位于 C 端 768 ~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。  基 因 型 简 要 说 明 DNA-BD 能够识别 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS，并与之结合。 而 AD 可以启动 UAS 下游的基因进行转录。BD 和 AD 单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈 现完整的 GAL4 活性，使含有 UAS 的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD 不与 AD 结合，将要 检测的蛋白质分别与 BD 和 AD 融合，形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD）， 如果 bait 和 prey 发生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的 GAL4，从而激活报告基 因的转录。 Y2HGold 有四个报告基因：AbAr, HIS3, ADE2, MEL1，分别由三种不同的启动子（G1，G2，M1）启 动，这三种启动子只有 GAL4 识别的 17bp 核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性 发生的概率。此外新报告基因 AbAr 与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降低 酵母双杂假阳性发生的概率。 High5 TM系列 Y2HGold 感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保 存三个月，经 PGADT7 质粒检测转化效率>10 4cfu/μg DNA 。 1. 取 1 管感受态细胞置冰上融化，6 000 rpm 离心 1min，去掉上清。 2. 加入 320 μl LiTE/PEG 溶液，重悬细胞，然后加入 10μl Carrier DNA(95-100 度 5min 快速冰浴， 重复一次)，预冷目的质粒 2-5ug,体积不多于 20ul（对酵母双杂交实验而言加入 10 μl pGADT7 质粒（约 1 μg），10 μl pGBKT7 质粒（约 1 μg））。 3. 充分混匀，于 30 度 250 rpm 转速下培养 30 min。 4. 42 度热激 2.5min。 5. 6000 rpm 离心 1min，去掉上清。 6. 加入 1 ml TE 溶液，温和重悬细胞。7. 6000 rpm 离心 1min，去掉上清。 8. 加入 100 μl TE 溶液，重悬细胞，将细胞涂布于相应的营养缺陷型固体合成培养基（对酵母双杂交 实验而言为 Trp 和 Leu 双营养缺陷型合成培养基）。 9. 30 度倒置培养 48-96h，直至形成大小合适的酵母菌落。1感受态细胞最好在冰上融化。 2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。 3. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。 4.Y2HGold 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为 27-30℃；高于 31℃，生长速度和转化效率呈指数 下降。 5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的 Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用，然而，Y2HGold 的 ADE2 基因 被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物 P-ribosylamino imidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。 6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为 例：涂 YPDA 平板 29℃，48h 培养可见直径 1mm 克隆；涂 SD 单缺平板 29℃，48-60h 培养可见直径 1mm 克隆，涂 SD 双缺平板 29℃，60-80h 培养可见直径 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板平板 29℃， 80-90h 培养可见直径 1mm 克隆。