Cas9 KO稳定株构建
产品名称： Cas9 KO稳定株构建
英文名称： CRISPR cas9 KO stable cell construction
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Cas9 KO 稳定株构建
一、产品描述
CRISPR/Cas9通过对靶DNA序列进行切割，利用细胞的非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复机制在DNA切割处随机产生Indels突变，从而导致编码基因读码框发生改变，产生功能缺失的蛋白，达到对该基因敲除的目的。通过对CRISPR/Cas9转染或感染的细胞进行单克隆/混合克隆分离培养后测序验证，可以筛选出目的基因有效敲除的单克隆细胞株进行后续科研实验。
二、方案流程
图1 实验评估及操作流程图
三、结果展示
1.将sgRNA克隆至表达质粒并转染293T细胞，72h后分选阳性细胞，抽提基因组DNA，进行T7E1检测，筛选切割效率最高的5’sgRNA-3用于后续质粒构建。
图2 sgRNA切割活性验证
2.通过荧光标签将阳性细胞分选至96孔板中进行单克隆培养。
图3 流式分选阳性细胞
3.单克隆株PCR鉴定：针对目的基因序列设计基因型鉴定引物，正反向引物设计在敲除片段两端，Control组通过PCR能够扩增出1065bp的片段,基因敲除组通过PCR能够扩增出219bp的片段。
4.将PCR鉴定正确的样品进一步进行测序鉴定
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