注意事项：

1.       质粒拷贝数: 纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1, B1, N3, RET, 100% ethonal 相同体积的DNA Wash Buffer和Endofree Elution Buffer.

2.       转化菌: 若为-70^oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。

3.       切勿直接取冻存的菌进行培养。

操作简要步骤：

1.   取100 µL新鲜的菌液接种到150-200 mL (勿超过 200 mL)的LB培养基（含适量抗生素），37^oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。

2.   加入10 mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。

3.   加入 10 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。 

4.   加入3 mL Buffer N3, 立即反转5次，用手用力摇晃3-5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。

5.   将离心管转至高速离心机，在室温下12,000 x g离心10分钟（若上清中有白色沉淀，可再次离心）。

6.   转移上清液20 mL（不超过20 mL）至新的50mL离心管中，加入0.5倍体积的Buffer RET (即每20 mL裂解液加入10 mL Buffer RET) 及10 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混匀，需马上离心过DNA柱。

7.   立即转移20 mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中，室温下> 2,500 x g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。将剩余溶液转移至DNA柱中，室温下> 2,500 x g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复直至所有的溶液通过DNA柱。

8.   可选：向离心柱中加入10 mL Buffer KB，室温下> 2,500 x g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。

9.   向离心柱中加入10 mL 70% 乙醇，室温下> 2,500 x g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“9”。

10.      将离心柱放回高速离心机中，室温下5,000 x g开盖离心10分钟，以彻底去除残留的乙醇。

11.      将离心柱转至一个新的50 mL离心管中，向DNA柱膜的正中加入1-1.5 mL 的Endofree Elution Buffer，室温放置1分钟，> 2,500 x g离心5分钟，以洗脱质粒DNA。将50 mL离心管中的洗脱液上柱再放置洗脱1分钟，> 2,500 x g离心5分钟。 两次洗脱将提高得率。