转录因子和组蛋白通过与DNA相互作用（DNA-Protein Interaction,DPI）发挥着调控基因复制、表达、重组和修复的重要作用，在实现细胞功能的过程中至关重要。其中转录因子组合决定了细胞的增值、分化以及死亡，是表观基因组学研究的重要组成部分。

研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要有凝胶阻滞实验、DNase 1 足迹实验、甲基化干扰实验、体内足迹实验和ChIP-seq等。基于NGS研究手段的ChIP-seq技术可以真实反应靶蛋白在全基因组上的结合情况，是非常经典的DNA结合位点分析方法，至今仍然在广泛使用。

ChIP-Seq的基本实验流程过程包括（图1）：甲醛交联将DNA结合蛋白和DNA紧密固定；然后抽提染色质，超声破碎DNA断裂，片段范围在200-500bp之间；抗体孵育结合靶转录因子，Protein A/G磁珠拉取抗体-蛋白-DNA复合物；蛋白消化后再通过PCR、芯片或者二代测序对DNA序列进行鉴定。

图1 ChIP-seq原理示意图[1]

看似简单，实则有几个技术难题，如果实验条件摸索不成熟会消耗大量时间。

• 首先，ChIP需要较多的细胞量，免疫共沉淀需要足够的靶标蛋白，而靶标蛋白有限的情况下就需要提供大量的细胞；

• 其次，信噪比低，很多转录因子和染色体的结合相对松散，需要甲醛强交联，以防止后续洗涤过程破坏这些结合，这样导致很多非特异性信号，需要更高的数据量得到真实peak值；

• 此外，实验的打断条件、重复性差等都需要系统的摸索才能得到较好的结果。

这些因素综合起来导致ChIP对新手非常不友好，需要采购特定的设备、很长时间的预实验才能得到满意的结果。

为了克服这些难题，CUT&Run以及更加成熟CUT&Tag被开发出来。2019年，美国弗雷德哈钦森癌症研究中心的 Henikoff 博士在 Nature Communication 公开了 CUT&Tag 技术的详细结果与实验方案。

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）技术，它免去了甲醛交联、超声破碎和免疫共沉淀的过程，这样既节省了初始实验材料又提高了信噪比、提升了实验重复性。

基本技术流程包括（图2）：首先，特异性抗体和靶标蛋白孵育结合；加入Tn5转座酶—Protein A复合物，其中Tn5转座酶两端已装载好建库接头引物；特异性抗体和Protein A相结合，转座酶Tn5被“拉”到转录因子附近；转座酶Tn5一次性完成附近DNA打断并完成NGS加接头过程，可直接建库[2]。基于CUT&Tag，单细胞转录因子结合位点的研究也成为可能[2]，这也展示了CUT-Tag的潜能。

图2 CUT&Tag原理示意图[1]

为证明Cut&Tag技术的有效性，Henikoff 博士在对组蛋白H3K27me3进行研究时对比使用了ChIP-seq、Cut&RUN、Cut&Tag三种方法。从不同角度对三组数据进行比较后，发现Cut&Tag技术具有显著优势，具体结果如下：

1. CUT&Tag 具有更好的信噪比和更低的背景

图3 ChIP-Seq 、CUT&RUN、CUT&Tag实验结果对比

2. CUT&Tag 在识别染色质特征时最高效

3. 重复性好，灵敏度高

图5 a：CUT&Tag、CUT&RUN、ChIP-Seq三种方法分析H3K4me1组蛋白修饰：CUT&Tag在识别染色质特征时最有效，能够给出ChIP-Seq无法读出的信息；b：peak-Calling的对比，使用默认参数调用每种方法上的峰值，结果显示CUT&Tag比CUT&RUN、ChIP-seq或ATAC-seq有更高的信号。

4. CUT&Tag 能对极少量细胞甚至单细胞进行分析

CUT&Tag 能够对极少量细胞（60 个细胞）甚至单细胞进行分析。由于 PCR 之前的反应都在细胞内进行，Henikoff 博士通过分配单个细胞到 5184 纳米孔，再加入带随机标签的引物进行扩增的办法，实现单细胞测序。

图6 CUT&Tag 单细胞测序流程

一个好的抗体是CUT&Tag成功的前提！这个抗体要能识别天然构象蛋白且特异性强，最好选用文献验证过的抗体，实验前并进行IP验证。如果实在没有合适的抗体，可以选择标签蛋白，如FLAG和HA等经过有效验证的单克隆抗体。