近日，北京大学刘涛教授课题组在Molecular Cell （IF=17.970）上发表了题为“Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a-based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates”的研究论文，文章报道了利用生物正交化学方法，将位点特异性修饰的Cas12a蛋白和5’端化学修饰的crRNA生成共价Cas12a-crRNA复合物（cCas12a），不仅提高了Cas12a系统在哺乳动物细胞中的基因组编辑效率，还能够用于CAR-T细胞制备中的精确基因敲入和多重基因编辑。本研究为Cas12a系统的广泛应用奠定了基础，同时也为改造其它低效的Cas家族成员提供了潜在思路。

针对Cas12a和crRNA的弱结合力问题，研究人员提出了Cas12a与crRNA共价交联的策略，通过基因密码子扩展技术在Cas12a核酸酶上定点引入了含有叠氮基团的非天然氨基酸，结合蛋白晶体结构分析，得到位点特异性修饰的Cas12a蛋白，并与5’端DBCO（二苯并环辛炔）修饰的crRNA共价偶联，生成了有活性的核糖核蛋白复合物（RNP）。此策略将Cas12a和crRNA共价连接成一个组分，RNP复合物可以直接传递到细胞中，在到达目标位点之前共价键还可以防止复合物解离，安全性及准确性均较高。

Cas12a-crRNA复合物的开发

1、cCas12a的设计与生成

研究表明，Cas12a crRNA的5’端经修饰后活性不会受影响，由此研究人员尝试将crRNA的5’端与Cas12a共价结合。首先确定了合适的交联位点为AsCas12a（来自氨基酸球菌属）蛋白的第806位甲硫氨酸（M806）,并通过非典型氨基酸诱变技术将其替换为含叠氮基团的非天然氨基酸AeF，生成了突变体AzCas12a。经体外DNA切割等实验检测证实AzCas12a与WT Cas12a具有相同的的核酸酶活性。随后，研究人员将5’DBCO修饰的crRNA通过叠氮-炔环加成反应共价连接到AzCas12a，生成了cCas12a RNP复合物，体外DNA切割试验证实了cCas12a RNP复合物的核酸酶活性。

图1. 位点特异性叠氮基修饰Cas12a的生成及与5’端修饰crRNA的共价结合

2、CRISPR/cCas12a在哺乳动物细胞中的基因编辑效率大大提高

cCas12a RNP复合物生成后，研究人员对其切割效率进行了验证：在HEK293-EGFP-Teton细胞中，cCas12a RNP对EGFP基因的编辑效率约是WT Cas12a和非共轭AzCas12a的3倍，而对HEK293细胞中5个内源性基因位点的编辑效率提高了1.6-18.3倍；在3种难转染细胞（K562、Jurkat和NIH/3T3）中,cCas12a RNP对相关基因的编辑效率也大大提高（2~4倍）。这说明，Cas12a与crRNA共价交联可以大幅提高不同细胞中不同位点的基因编辑效率。

图2. CRISPR/cCas12a在哺乳动物细胞中的基因编辑效率大大提高

3、CRISPR/cCas12a脱靶效应的评估

接下来，研究人员对CRISPR/cCas12a的脱靶效率进行了评估。首先，使用GUIDE-seq方法评估了cCas12a和WT Cas12a RNPs对HEK293细胞中三个不同基因位点（hHPRT1、GUK1和DNMT1）的靶效率和脱靶效率。结果表明，cCas12a对3个基因的打靶率增加了2-6倍。此外，cCas12a对hHPRT1和GUK1基因的脱靶切割未检测到。对于本身脱靶率极高的DNMT1基因，研究人员也确实检测到了cCas12a对DNMT1的非靶向切割。这些数据表明，cCas12a RNP复合物可以大幅提高基因的靶上编辑效率，而脱靶效应的风险可能取决于crRNA的内在序列特异性。