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IHC 实验常见问题
1、染色过强
原因：抗体浓度过高或孵育时间过长
解决办法：降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1 小时或4 度过夜
原因：孵育温度过高超过37 度
解决办法：一般在室温20-28 度
原因：DAB 显色时间过长或浓度过高
解决办法：显色时间不超过5-12 分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
原因：操作过程中冲洗不充分
解决办法：每步冲洗3 次每次5 分钟
原因：组织中含过氧化物酶未阻断
解决办法：可再配置新鲜3%H2O2 封闭孵育时间延长
原因：组织中含内原性生物素
解决办法：正常非免疫动物血清再封闭
原因：血清蛋白封闭不充分
3、染色弱
原因：抗体浓度过低、孵育时间过短
解决办法：提高抗体浓度、孵育时间不能少于60 分钟
原因：操作中添加试剂时缓冲液未沥干
解决办法：每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释 （应防止切片干燥）
原因：室温太低，低于15 度
解决办法：要改放在37 度孵育箱孵育30-60 分钟或4 度冰箱过夜
原因：蛋白封闭过度
解决办法：封闭不要超过12 分钟
4、染色阴性
原因：操作步骤错误
解决办法：应重试，设阳性对照
原因：组织中无抗原
解决办法：设阳性对照以验证试验结果
原因：一抗与二抗种属连接错误
解决办法：仔细确定一抗二抗种属无误